BMP-2/大鼠骨成型蛋白2檢測試劑盒
簡介
骨成型蛋白2或BMP-2屬于TGF-β超家族蛋白。BMP-2與其他骨形態(tài)發(fā)生 蛋白一樣，在骨和軟骨的發(fā)育中起著重要作用。它參與刺猬途徑、TGF-β信號 途徑以及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用。 它還參與心肌細(xì)胞分化和上皮 細(xì)胞向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化。與BMP家族的許多其他蛋白一樣 ， BMP-2已被證明能有 效地誘導(dǎo)各種類型的細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞分化。 BMP-2可能參與白色脂肪的形 成 ，并可能有代謝作用。 骨成型蛋白2已被證明與BMPR1A相互作用。

本試劑盒大鼠BMP-2免疫測定是一種三步法固相夾心ELISA，用于測量細(xì) 胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的大鼠BMP-2。試劑盒包含大腸桿菌表達(dá)重組  大鼠BMP-2和針對重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然大鼠BMP-2獲得的結(jié)果顯 示出與使用重組標(biāo)準(zhǔn)品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線平行的線性曲線。這些結(jié)果表明，該試 劑盒可用于測定天然大鼠BMP-2的相對質(zhì)量值。

檢測原理

試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù)：將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上 ，捕獲  樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測物BMP-2 ， 孵育清洗后 ，再加入標(biāo)記的檢測抗  體進(jìn)行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫復(fù)合物 ，隨后加入  鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育 ，待孵育結(jié)束后清洗 ，接著加入  TMB顯色液后 ，若樣本中有待測物則顯藍(lán)色 ，則加入終止液停止反應(yīng)。檢測  過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450nm處測OD值，顏色的深淺和樣  品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中BMP-2的濃度。

操作要點

1. 混合蛋白質(zhì)溶液時，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨使用容器。

2. 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。

3. 當(dāng)使用自動洗板機(jī)時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。

4. 顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無色變?yōu)樗{(lán)色。

5. 應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機(jī)；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
注意事項

1. 本試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。

2. 本試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

4. 佩戴防護(hù)手套、眼睛和面部防護(hù)用品，處理后洗手。

試劑準(zhǔn)備

1. 使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

2. 洗滌液/稀釋液配置：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1: 20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
BMP-2/大鼠骨成型蛋白2檢測試劑盒
標(biāo)準(zhǔn)品配置

試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個試管，先從20ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200 μL） 按需吸取一定量用1 ×稀釋液稀釋1000pg/mL（例： 50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液 +950μL的1 ×稀釋液，制備得到1000μL的1000pg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1 ×稀釋液 ，在這6個單獨的試管中1000pg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個梯度 ， 共配制7個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 ， 依次為： 1000pg/mL 、  500pg/mL 、  250pg/mL 、  125pg/mL 、  62.5pg/mL、31.25pg/mL、  15.625pg/mL ，從濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品  到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示）， 1 ×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0pg/mL)。

結(jié)果的計算
計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（作圖時去掉空白組的值）或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計算樣本結(jié)果
靈敏度

經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度7.81pg/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別天然和重組大鼠BMP-2。

其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。

實驗步驟匯總
1. 加標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，37℃避光反應(yīng)1.5h，洗滌3次。

2. 加檢測抗體，37℃避光反應(yīng)1h，洗滌4次。

3. 加酶結(jié)合物，37℃避光反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。

4. 加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。

5. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。

大鼠骨成型蛋白2用于定量檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中大鼠的BMP-2使用本產(chǎn)品之前，必須完整閱讀本說明書，大鼠ELISA試劑盒僅供科研使用，不能于其它診斷。